Pitanje:
Metode normalizacije s RNA-Seq ERCC skokom?
SmallChess
2017-05-17 10:24:25 UTC
view on stackexchange narkive permalink

ERCC uvlačenje skup je sintetičkih kontrola razvijenih za RNA-Seq. Zanima me da ga koristim za normalizaciju uzoraka RNA-Seq. Konkretno, želio bih upotrijebiti spike-inove za uklanjanje tehničke pristranosti i svih varijacija koje ne bi trebale biti dio moje analize.

Web mjesto ne daje nikakve detalje o tome kako to mogu učiniti .

P: Koje su moguće strategije normalizacije? Možete li ih ukratko opisati?

Jeste li zainteresirani za skupno ili jednoćelijske RNA-seq? Vrijednost šiljastih unosa znatno se razlikuje, ovisno o tome
Dva odgovori:
#1
+9
Scott Gigante
2017-05-17 10:43:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Možete razmisliti o upotrebi RUVSeq. Evo izvatka iz publikacije o biotehnologiji iz 2013.:

Procjenjujemo uspješnost usporenih kontrola External RNA Control Consortium (ERCC) i istražujemo mogućnost koristeći ih izravno za normalizaciju. Pokazujemo da spike-inovi nisu dovoljno pouzdani da bi se mogli koristiti u standardnim postupcima normalizacije na globalnom skaliranju ili regresiji. Predlažemo strategiju normalizacije, koja se naziva uklanjanje neželjenih varijacija (RUV), a koja prilagođava tehničke učinke smetanjem izvođenjem faktorske analize na prikladnim skupovima kontrolnih gena (npr. ERCC spike-ins) ili uzoraka (npr. Replicirane knjižnice).

RUVSeq u osnovi odgovara generaliziranom linearnom modelu (GLM) na podatke izraza, gdje je vaša matrica izraza $ Y $ matrica $ m $ by $ n $, gdje je $ m $ broj uzoraka i $ n $ broj gena. Model se svodi na

$ Y = X * \ beta + Z * \ gamma + W * \ alpha + \ epsilon $

gdje $ X $ opisuje uvjete interesa ( npr. liječenje u odnosu na kontrolu), $ Z $ opisuje promatrane kovarijante (npr. spol), a $ W $ opisuje neprimjećene kovarijante (npr. šarža, temperatura, laboratorij). $ \ beta $, $ \ gamma $ i $ \ alpha $ su matrice parametara koje bilježe doprinos $ X $, $ Z $ i $ W $, a $ \ epsilon $ je slučajni šum. Za podskup pažljivo odabranih gena (npr. ERCC dodaci, geni za održavanje ili tehničke replike) možemo pretpostaviti da su $ X $ i $ Z $ jednaki nuli, i pronaći ćemo $ W $ - "neželjenu varijaciju" u vašem uzorku.

#2
+4
gringer
2017-08-02 03:16:10 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Dodali smo ERCC spike-ins svim našim RNASeq podacima, samo u slučaju da bi drugi ljudi mogli smatrati korisnim u budućnosti. Međutim, nikada ga nisam koristio u vlastitim analizama jer ne mogu smisliti razuman način na koji bi se mogao koristiti.

Tipična preporuka za ERCC je dodavanje proporcionalno ulaznoj količini RNA , ali to pretpostavlja da je ukupan broj RNA stanica sličan u različitim stanicama (što je očito netačno gledajući rezultate RNASeq jednoćelija).

Još nisam smislio situaciju u kojoj bi ERCC pružio bolje rezultata nego skup gena za "održavanje" uzorkovan iz izvornih čitanja.

Zašto biste ubacili ERCC ako nemate nikakve koristi?
Radimo istu stvar, potrebna dubina sekvenciranja je stvarno mala, tako da je jeftina i "bolje sigurno nego žao".
Pokušali smo pronaći stvari koje bismo mogli dodati, što bi značilo da ubuduće ne bismo trebali ponavljati trčanja.
Jedna od potencijalnih prednosti je ta da ako se čini da ste pretjerani u određenim uzorcima (npr. VELIKI postotak čitanja koji idu na ERCC), tada znate da je nešto pošlo po zlu s nukleinskim kiselinama (npr. Loša ekstrakcija, prenizak unos itd.).
Da, pretpostavljam da su ERCC razumna pozitivna kontrola za pripremu uzorka. Ta se pitanja pripreme uzorka često pojavljuju i na druge načine (npr. Visok udio ribosomskog mapiranja, niska stopa mapiranja, GC razlika, broj prijepisa izraženih iznad razine X, PCA).


Ova pitanja su automatski prevedena s engleskog jezika.Izvorni sadržaj dostupan je na stackexchange-u, što zahvaljujemo na cc by-sa 3.0 licenci pod kojom se distribuira.
Loading...