Pitanje:
Kako mogu poboljšati prinos izvođenja sekvenciranja MINION?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ovo je često postavljano pitanje u zajednici nanopora. Oxford Nanopore trenutno tvrdi da mogu generirati prinose od 10-15 gigabaza (npr. Pogledajte ovdje i ovdje), a ipak je uobičajenije vidjeti korisnike koji upravljaju samo u raspon 1-5 gigabaze.

Pa zašto velika razlika u prinosu?

Tri odgovori:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Prisustvovao sam razgovoru Josha Quicka na PoreCampAU 2017, u kojem je razgovarao o nekim uobičajenim preprekama za postizanje dobrog prinosa sekvenciranja i dugog čitanja. Uglavnom se svodi na oprez s pripremom uzorka. Imajte na umu da će MINION i dalje slijediti prljavi uzorak, samo će biti smanjenog prinosa. Evo mojih napomena iz tog razgovora:

  • Najteža stvar u vezi sa sekvenciranjem MinION-a je prvo dobiti uzorak
  • Postoji puno različitih vrsta uzoraka i metoda ekstrakcije
  • Ne možete dobiti duže čitanje od onoga što ste stavili; usrano dovodi do sranja
  • DNA je vrlo stabilna kad se ne kreće, ali je vrlo osjetljiva na bočna oštećenja
  • Metoda fenol-kloroformnog izvlačenja DNA vrlo je dobra i može se koristiti s gel sa faznim zaključavanjem koji olakšava ekstrakciju
  • Jednostavna ekstrakcija soli i alkohola mogla bi biti najbolja metoda za ekstrakciju (jer uključuje najmanje rada na DNK)
  • EDTA (npr. kao što je pronađeno u TE međuspremniku i mnogim ekstrakcijskim kompletima) nije kompatibilno s brzim priborom
  • Najdosljednija izvođenja Nanoporea koja je proizveo Joshov laboratorij bila su 1D podvezivanja na R9.4; najbolja ukupna serija bila je ekstrakcija fenol-kloroforma + brzi komplet
  • John Tyson se može izvući iz rupe s malim prinosom (putem softvera)
  • Dobivanje malog broja kratkih čitanja je vrlo važne
  • Predložene (i uglavnom neprovjerene) tehnike pročišćavanja: centrifuga (60-100kb); ekstrakcija etanola (100-150kb), dijaliza (150-250kb); agarozni čep s niskom točkom topljenja (~ 1 MB, ekstrakcija DNA in situ)
  • Ulaz protokola nanopore nalazi se u nanogramima, ali bi ga stvarno trebalo navesti kao molarnost; komplet očekuje ulaz od oko 0,2 pmol
  • Molekule slike privezane za površinu membrane. Tada možete vidjeti da je gustoća protočne stanice neovisna o duljini niza
  • Tapestation, Qubit i Nanodrop dobra su ideja; uzorak DNK koji može proći sva tri testa dobro će funkcionirati: nema kratkih ramena Tapestationa, dovoljne DNA Qubita, visoke čistoće Nanodrop
  • RNA može ometati sekvenciranje; preporučuje se probavljanje RNA
  • Zamrzavanje DNK stvarno je loša ideja. Kristali leda vrlo su dobri u usitnjavanju DNA na male komadiće
  • DNA koja se čuva u hladnjaku izuzetno je stabilna; može se čuvati više od dvije godine (i vjerojatno unedogled)

Ažuriranje prinosa:

Imali smo niz u lipnju 2018. koji je proizveo oko 3 milijuna čitanja s PCR- pojačana cDNA miša (čitaj N50 od ~ 1 kb), i to u situaciji kada je to bio prvi uzorak koji je netko pripremio, ulazna količina DNK vjerojatno je bila oko 20% od one koja je trebala biti, a mi smo pretrpjeli incident zbog gubitka podataka . Ako se to dogodilo s lošim trčanjem, polažem velike nade u naša trčanja u budućnosti.

Sljedeće cDNA pokretanje u kolovozu 2018. proizvelo je oko 7 milijuna očitavanja i slično očitanje N50 (tj. Ukupan prinos od oko 7Gb). Izvođenje je prekinuto ažuriranjem sustava Windows tijekom prve noći (prethodno sam onemogućio automatska ažuriranja, ali bila su ponovno omogućena), a od tada je bilo dodatnih softverskih i hardverskih ažuriranja radi poboljšanja prinosa sekvenciranja. Ako imamo dobru protočnu ćeliju i sličnu pripremu uzorka, očekujem da bi sljedeći cDNA postupak koji ćemo napraviti trebao proizvesti preko 8 milijuna očitavanja, a možda i preko 10 milijuna.

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Kladim se da su ljudi nanopore (naravno!) napravili tonu optimizacije na dvije ključne stvari:

  1. čišćenje DNK
  2. priprema biblioteke

Onda se sve svodi na pripremu za knjižnicu, a odgovor @ gringer-a ima nekoliko dobrih savjeta o tome.

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Radim s gljivicama i koristim CTAB metodu za ekstrakciju DNA i koristio sam brzi komplet za početnu pripremu za biblioteku, ali nije uspio i od tada koristim komplet za ligaciju i daje mi vrlo dobre rezultate . Uspio sam dobiti podatke u rasponu od 4 GB do 13 GB.



Ova pitanja su automatski prevedena s engleskog jezika.Izvorni sadržaj dostupan je na stackexchange-u, što zahvaljujemo na cc by-sa 3.0 licenci pod kojom se distribuira.
Loading...